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      ChIP-seq实验详细解读

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      • 发布时间:2021-12-08 16:51
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      【概要描述】大家已经对这个技术有了初步的了解。 本文将详细介绍ChIP-seq的实验部分。 ChIP是染色质免疫共沉淀法,其核心思想是利用特异性抗体结合相应的DNA的片段和组蛋白,那么,下面一起了解下ChIP-seq实验详细解读吧!

      ChIP-seq实验详细解读

      【概要描述】大家已经对这个技术有了初步的了解。 本文将详细介绍ChIP-seq的实验部分。 ChIP是染色质免疫共沉淀法,其核心思想是利用特异性抗体结合相应的DNA的片段和组蛋白,那么,下面一起了解下ChIP-seq实验详细解读吧!

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        大家已经对这个技术有了初步的了解。 本文将详细介绍ChIP-seq的实验部分。 ChIP是染色质免疫共沉淀法,其核心思想是利用特异性抗体结合相应的DNA的片段和组蛋白,那么,下面一起了解下ChIP-seq实验详细解读吧!

      ChIP-Seq

        实验时需要考虑:

        (1)只有按照研究目标,研究使用特异性抗体,才能有效浓缩DNA的片段; )对于不同的细胞类型,为了得到完全且充分的细胞核,需要使用特定的细胞核提取方法。 ChIP-seq中的“seq”是指一般/标准的序列文库构建。 ChIP-seq的主要难点是免疫共沉淀时使用的抗体是否容易使用,以及能否用足够的量提取出完整的细胞核。

        ChIP-seq和抗体的选择

        1)抗体的质量选择。 抗体可以细分为三类:单一蛋白质抗体、组蛋白抗体和标签抗体。 在抗体质量要求上,ChIP实验的抗体必须是ChIP/IP水平以上的抗体。 由于ChIP实验的抗体在生物体内具有天然活性,以天然纪念物的抗体为对象,所以产生抗体可以使用生物体内纯化的天然蛋白,也可以使用纯化的重组蛋白。 避免人工合成肽产生抗体。 因为这种抗体的抗原识别部位可能会因肽链被折叠形成结构而隐藏。

        2)根据实验目的选择抗体。 如果研究组蛋白修饰,可以购买公司成熟的商品化抗体,提高实验成功率。 在调查特定的转录因子与全部基因组的结合部位时,需要使用以该转录因子为抗原产生的特定抗体,但是在难以获得抗体或效果差的情况下,也可以使用标签抗体。 对象是植物时,这个方法更好。

        3)标签抗体:主要有His、GFP、Flag、HA等。 使用标签抗体的方法:1.构建标签蛋白质和目标转录因子的融合抗体; 2、导入生物体内获得稳定的转基因抗体; 3 .利用针对标签蛋白质的抗体进行ChIP。 但是,标签系统有一定的风险。 1、标签蛋白质融合后是否影响转录因子与DNA的结合能力; 2 .标签蛋白质本身是否具有结合DNA的能力。 这产生假阳性结果; 3 .标签融合蛋白质和原转录因子是否竞争性地与DNA结合,减弱ChIP的浓缩。

        ChIP-seq的实验流程

        在合理地实验了设计方案之后,我们正式开始了ChIP-seq的实验。 ChIP-seq实验主要有以下步骤。

        1)组蛋白交联和细胞核的提取

        2)核膜破裂和基因组碎片化

        3)事前去除和免疫沉积

        4)脱交联和DNA纯化

        5)末端修复和连杆接头

        6)纯化和片段筛选

        7)文库放大和质量检查

        在此,进行免疫共沉淀前必须设置对照组、重复组。 重复组不仅需要生物学上的重复,也需要技术上的重复,无重复的实验结果可能因随机实验误差而难以接受。 对照组有input和阴性对照两种。 input对照主要是指未加抗体的对照组,其主要目的是消除背景噪声。 不同染色质结构复杂,碎片化效果稍差,因此相对常染色质区稍有富集。

        不进行input对照,除了会导入这部分的假阳性结果外,还可以根据input和treatment中靶序列的含量,按照样本量的比例计算ChIP的浓缩效率,从而考察抗体是否有效特异。 阴性调控主要用于标签抗体的使用时,以仅标签蛋白质的载体为对照,去除标签抗体非特异性结合产生的背景噪声,去除该部分的假阳性结果。

        以上介绍的就是ChIP-seq实验详细解读,如需了解更多,可随时联系我们!


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